最近再FPLC做報告,不能懂FPLC與HPLC有什麼不同,
又為什麼HPLC不能用於純化蛋白質?
2006-11-19 11:19:20 · 2 個解答 · 發問者 Mi 2 in 科學 ➔ 化學
液相層析儀一般來說可分為2 種: (a).FPLC(fast performance liquidchromatography)通常是用於大量制備和純化蛋白質時所使用(b).HPLC(high performance liquid chromatography)用於分析蛋白質,是使用高壓推動的方式加速層析過程,然而其中又可在細分為6種層析方式: (1).膠體過濾法:是以膠體間的縫隙大小和形狀來分離蛋白質,若大分子不能很輕易通過或是形狀怪異的都會因為不容易通過膠體而緩慢移動,如果相反者則快速通過column,達到分離蛋白質的效果 (2).離子交換法:利用蛋白質分子在不同的pH 值中有不同帶電荷,而選用各種材質(帶有電荷)與蛋白質間的親合力強弱達到分離效果 (3).親合層析法:利用蛋白質分子表面上的專一性分子與column 內的填充液之間鍵結關係,達到分離的效果.高壓液相層析法（high pressure liguid chromatography，簡稱HPLC）的原理是，以高壓將作分析的裝填物擠壓在鋼管內，如此可使試料在鋼管中的滯留時間（retention time）增長，分析能力也因而增大。由於裝填物壓得非常結實，液體如依本身之重力不能順利通過層析管，必須加壓才行通過。因此作HPLC實驗時最忌在試料、溶劑或沖洗液中有雜質或微粒存在。因為這些微粒在層析管中堆積起來，會把已經相當窄小的通道堵塞，使得實驗需更高的壓力才能進行，終將導至層析管報廢。你可以想象一般的管柱層析，只不過以高壓高流速來粹取，優點是可回收樣品，注入的樣品量較少，分離樣品快速，但這些都是針對在一般分析時的需求，如果是針對需要回收樣品的話，它的量太少，需要多次分離，雖然最近有可以一次打幾個mg的管柱出現，用於分離較低分子量的peptide，例如我剛合成一段peptide，但可能不是很乾淨，此時便可使用HPLC來分離出我需要的樣品。FPLC 是快速液態層析儀，其實其原理跟HPLC差不多，一樣是用pump來加壓加速分離的，但它的管柱和HPLC不一樣，其管柱外殼一律是用塑膠材質，故使用的壓力與流速，便不像HPLC那麼強，(哪種塑膠我就不知道囉)它主要是用來分離蛋白質用的，可以分離的量也較大，很多人一定會覺得奇怪，用HPLC也是一樣的呀，為何一定要用FPLC呢??這是因為蛋白質可能會跟HPLC的金屬管壁鍵結(bind)在一起，如此就得不到所要的蛋白質了，且蛋白質也可能因為高壓而變性，也是得不到想要的蛋白質，價格上HPLC較便宜，大概30萬就能買到不錯的了...而FPLC就要很多錢囉，而且台灣這邊只有一個香港商的安法瑪亞在代理，貴死囉，我實驗室那一台沒有電腦連線的好像就要五十萬吧，型號我忘了，在維修上呢，HPLC較FPLC簡單(找人來一下子就解決了)，FPLC常出問題，一下子Oring老化要換，一下子pump的酒精不夠要加，而當過壓的情形太常發生時，就代表著過濾部份的membrane要換了...煩的呢...
2006-11-20 20:55:08 · answer #1 · answered by Sai 6 · 0⤊ 0⤋
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2015-03-31 03:52:58 · answer #2 · answered by 小黎 1 · 0⤊ 0⤋