請簡述DNA選殖步驟

Question

請問有人對DNA選殖的步驟了解嗎?
生物分析技術有讀到
可是看不太懂ㄝ

大一才剛學到而已
所以還不用牽扯到分子生物學的部分

Answer 1

DNA選殖 (DNA cloning)也可以。不過一般更常用gene cloning (基因選殖)，亦即於library中挑選出含有某特定基因的細胞株 (clone )。大致的過程如下：1.      先以限制酶切割chromosome DNA為適當的片斷；(同學會學到限制酶的種類、切割 DNA的方式、性質等)2.      載體 (vector) 也用相同的限制酶處理，(同學會學到載體的種類、特性、性質等)3.      將DNA片段與載體以DNA ligase連接；4.      進行轉形作用 (transformation or transfection)[註]：對原核細胞的轉形稱 transformation；         對真核細胞的轉形稱 transfection)。5.      將菌液塗佈於培養盤上；6.      挑選出 ( selection) 成功轉形且具有外插 DNA的質體；(同學會學到應用各種selection marker協助挑選成功轉形的菌株)7.      便得到該物種的genomic libraries；(亦即將所有該物種的基因組片段的菌珠，所構成的集合。)8.      偵測(detection) 欲選殖的基因位於哪一個菌珠中；(同學會學到雜交法 (hybridization)，亦即以32P標記的探針與欲選殖的基因互補的方式偵測)[註]：以上每一觀念都是分子生物學中很重要的主題 (在分子生物的課程會敎)考研究所的同學一定要會。Dr. 陳皓

Answer 2

DNA選殖(DNA cloning)目的：帶有特定基因的質體在分子生物研究上，是一個很重要的工具，將特定基因接入載體(vector)完成質體建構後，可以對特定基因做進一步研究。也就是說將已經過聚合脢連鎖反應(PCR)處理過之產物樣品接入載體內，建構一帶有特定cDNA的質體。原理：首先要純化PCR產物。 將PCR反應進行瓊膠電泳，把所要的DNA片段切下，放入透析袋中，再將透析袋放入電泳槽內進行電泳，DNA會跑出瓊膠，但不能跑出透析袋，最後將透析袋內溶液吸出，沉澱濃縮即可。另外，在進行質體建構之前，需先將載體以限制脢切開。 材料 ：10X loading buffer：20% Ficoll 400，0.25% Bromophenol blue，0.25% Xylene cyanol 透析膜袋(dialysis membrane tubing)：Spectrum Medical Industries, Inc., Spectra/Por MWCO 12-14,000 10X T4 DNA ligase buffer：300 mM Tris-HCl (pH 7.8)，100 mM MgCl2，100 mM DTT，10 mM ATP pGEM-T Easy：50 ng/ml T4 DNA ligase：3 Weiss units/ml步驟：(一)純化DNA片段 ：1. 將已處理過之PCR反應液以酒精沉澱，回溶於10 ml TE。2. 加入1 ml 10X loading buffer，混合後載入2%瓊膠，進行電泳。 3. 電泳後，將瓊膠置於紫外光箱上觀察，把含有所要之DNA片段的瓊膠部位切下。 4. 將切下的瓊膠塊置入透析袋內，加入適量TAE buffer，再將開口夾住，將透析袋放入電泳槽內進行電泳。電泳時間約15分鐘，將電極逆轉後再電泳約15秒。 5. 將透析袋取出，打開一端的夾子，將溶液吸到一微量離心管中，再以酒精將DNA沉澱，回溶於10 ml TE。 (二)  DNA連接反應 ：1. 於微量離心管中加入以下物質，並完成混合：   蒸餾水      2 ml   10X T4 DNA ligase buffer 1 ml   pGEM-T Easy    1 ml   純化之PCR DNA片段  5 ml   T4 DNA ligase    1 ml 2.  這樣就完成DNA選殖．再將其置於4 oC冰箱中備用．之後進行基因轉型(gene transformation) 到你要的菌種。