請問melting curve?

Question

請問一下：
在利用real-time PCR定量時，會用到melting curves，想請問，什麼是melting curves？可以給我詳細的說明嗎？還有，我要怎麼利用real-time PCR針對純菌（腸內菌）還有混菌進行定量呢？還有定量結果如何與傳統定量方法比較？問題可能需要專業一點的答案，希望各位專家大大們提供囉！
非常非常的感謝！

Answer 1

問題一解答：
melting curves (Tm)：雙股DNA經加熱分解成單股，當有50%雙股DNA分開成單股時的溫度稱為熔解溫度。

問題一說明：
PCR的反應包括三個主要步驟，分別是
1). Denaturation ：所謂 Denaturing乃是將DNA加熱變性（90℃-96℃）， 將雙股的DNA加熱後轉為單股DNA以做為複製的模板.所以利用real-time PCR時必須知道melting curves (Tm)，才能有效的進行放大。
2). Annealing of primers：而Annealing （25℃-65℃）則是令 Primers於一定的溫度下附著於模板DNA兩端。
3). Extension of primers：最後在DNA合成酵素 (e.g. Taq-polymerase) （70℃-75℃）的作用下進行引信的延長及另一股的合成 (Extension of primers)。(Taq酶在72℃左右最佳的活性)

問題二解答：
純菌的定量：
可以使用螢光進行PCR定量時(PCR ELISA)，螢光信號與產物模板數成一一對應的關係，檢測螢光的信號就可以對PCR產物定量。但是，在使用終點法測定的重複性並不好。由此PE公司於1996年發明了實時螢光定量PCR，臨測每個循環的螢光強度，並使用Ct值進行分析，很快得到大家的接受，廣為應用。
當擴增越靠後定量的重複性就越差，在Ct值所在處重複性卻驚人的好。Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應管內的螢光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。而所設閾值都很低。還而言之，Ct值分析實際上就是低濃度的螢光值分析。由於是低濃度，影響因素小，誤差沒被放大，所以具有良好的重現性。

混菌定量：
利用針對各種混合菌基因成分特異性序列的探針和引物的組合進行多重 PCR 。多重 Real-time PCR 中，因為這需要用不同的螢光素來標記不同的探針，而 Real-time PCR 中螢光的發射光譜是很難實現對不同螢光探針的區分的。除了引物的特異性外，多重熔解曲線分析的設計要求每一個不同的 DNA 擴增產物的解鏈溫度必須各不相同。儘管目前的程序加入了新的參數從而可以準確估計十分接近的相鄰解鏈溫度，但特定的 PCR 反應效果仍然很難準確地確定。對於成功進行多重 PCR 尤為重要的因素是：用於擴增不同基因的不同引物對之間的相對濃度、 PCR 緩衝液的濃度、循環溫度、氯化鎂和 dNTP 濃度間的平衡。

問題三解答：
傳統定量方法：
就是定量PCR在核酸濃度上的簡單定量，由於之前想在分子操作過程中知道核酸的濃度，主要應用的方法是瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計，但是這兩種方法前者靠主觀判斷，造成的偏差較大，後者很易受樣品中染質影響。因此定量PCR由於其靈敏度高、特異性強、無污染性和準確性等特點當然成為了首選。

PCR－ELISA相對於凝膠光密度定量，無論是靈敏度、特異性、準確度上都是很大的提高，能滿足臨床要求。它為PCR提供了第一個嚴格意義上的定量方法。並且對儀器要求較低。只要有擴增儀和酶標儀就可以進行。