以HPLC檢測spectrum比對問題

Question

以HPLC檢測,如果Standard 的PDA spectrum 和sampl差很多(其實樣子是很像，但可能是因Standard和sampl濃度差很多)很難比對，不知有什麼解決的方法，在此有二個想法：第一：增加Sample 的濃度，(困難點在於還沒以HPLC檢測之前並不知Sample 的濃度，該稀釋多少很難事前知道?)，第二：增加Sample的量(如此儀器要換配備)，若我的二個想法是可行，如「增加Sample 的濃度」我是否又要重新萃取Sample(蠻費時的)，不知還有沒有其它方法?謝謝！

To：我愛棒球
從您的回答可知我的問題可能不夠清楚，當Sample濃度很低時其Spectrum 是很平的，幾乎看不出什麼起伏，很難比對，但從兩位的回答讓我有另一個新的思考方向，先前我只想到要重新萃取sampele很麻煩，從另一個角度看，若減少Standard 的濃度，趨近Sample濃度互相比對，這樣不知可行嗎?在此會擔心的是濃度都那麼低的狀況下，Spectrum 都很平，這樣比對，正確性勘慮！

比對時都是以該化合物的最佳吸收波長來比對。

Answer 1

定性分析方面:PDA detector不是可以設定許多種波長嗎?像我用三津公司的PDA detector同時可以設定8種波長,從200nm到800nm都可以設定!你先就文獻有用過的波長去設定,如果standard和sample的波形很相似的話,兩個PDA spectrum 可以重疊放在一起,那就可以確定兩者是相同的化合物!定量分析方面:你可以用自己配好的已知濃度的standard和萃取後未經稀釋過的sample兩者各試打一針去跑HPLC,比較一下它們兩者的peak area比值,先大致推測一下未經稀釋過的sample的濃度,在推測濃度的上下幾倍,去配置已知濃度的standard,例如:你推測的sample濃度是150ppm,則配置至少三種濃度(例如50,100,300ppm的standard,去跑HPLC,得到standard的檢量線,再跑sample的HPLC一次,就可以用standard的檢量線的方程式去求得sample的濃度啦~~此實驗跑sample的HPLC三次,乃為三重複,去求sample的平均濃度和標準偏差即可代表sample的濃度!

2006-03-15 16:25:55 補充：
你實驗室有分光光度計嗎?spectrophotometer通常都有[波長掃描]的功能!使用方法問你實驗室的儀器保管人!你先將sample取1ml放入石英cuvette中,用光度計的[波長掃描]功能,從0nm掃描到1100nm,就可以得知sample的最大吸收波長是在哪些nm了!將這些最大吸收波長輸入PDA detector中,sample和standard各跑一針HPLC,比較兩者光譜圖的差異性,如果滯留時間相同,就可以確定sample和standard是相同的化合物!

2006-03-15 16:26:41 補充：
至於定量方式,通常以稀釋standard較好處理,因為sample的每次萃取的回收率很難控制,因此比較不可能從sample處下手!通常是以調配不同濃度的standard來抓sample的濃度!

2006-03-15 16:35:46 補充：
當Sample濃度很低時有可能是你的萃取溶劑不對,所以sample的萃取回收率偏低,可能要換萃取溶劑了!另外sample的濃度若是小於1ppm,則用GC/MS或LC/MS分析較佳,GC/MS的偵測極限可到1ppb,HPLC的偵測極限只到1ppm,因此當Sample濃度很低時可考慮用GC/MS或LC/MS來分析!

Answer 2

如果您是要做spectrum比對,建議您濃度不要相差太多,雖然理論上相同成分但不同濃度圖譜應該是相同的,但是以實際經驗上其實不是那麼絕對,尤其在濃度低的時候會發現會有變形的情況,所以1.如果可以的話請您提高樣品的濃度,除了易於比對外,也能避免受到noise的干擾;2.如果提高樣品濃度有困難,請您配置不同濃度範圍的標準品來建立圖譜,您的樣品再與適當濃度範圍的圖譜來做比對.以上所比對出來的數據應該可性度較高.

Answer 3

滯留時間ㄧ致的話 光譜相似 那幾乎可以確定 啦
就你的實驗 可以稀釋STANDARD的濃度阿