如何做DNA的純化?

Question

如題
希望能描述
目的
步驟
及其應用

Answer 1

2.2 DNA 純化方法
本研究中所有DNA 的純化均採用商業化的純化藥品組件，而各
種DNA 的純化方法詳述如下：
2.2.1質體純化(Purification of Plasmid DNA)
研究室中利用QIAGEN 公司所生產QIAprep Spin Miniprep Kit純化組來萃取大腸桿菌中的質體。首先，取3 mL 培養至適當濃度的菌液，離心後移除上層液，接著加入250μL 已經含有RNase A 的Buffer P1，與菌體充分混合，然後加入250μL Buffer P2，緩慢正反翻轉混合4 ~ 6 次，再加入300μL Buffer N3，立刻緩慢正反翻轉充分混合4 ~ 6 次，以轉速13000 rpm 離心10分鐘。吸取上層液置於純化組中所附的離心管柱(QIAprep spin column)中，在常溫下以13000rpm 離心1 分鐘後，丟棄下層液，接著加入0.5 mL 的Buffer PB 置於離心管柱中，以轉速13000 rpm 離心1分鐘，丟棄下層液，再加入0.75 mL 的Buffer PE 置於離心管柱中，以轉速13000 rpm 離心1分鐘，丟棄下層液，再以轉速13000 rpm 離心2 分鐘移除殘留的Buffer PE。最後，將上層套管(QIAprep column)放入乾淨的離心試管中，並加入50μL 的Buffer EB(10mM Tris-Cl , pH 8.5) 或 dH2O 到套管中，置室溫下等待1分鐘後，以轉速13000 rpm 離心2 分鐘，離心試管內的液體即為所欲純化的質體，將質體置於4℃可暫時保存，若要永久保存，則必須儲存於-20℃下。
2.2.2瓊脂凝膠萃取DNA片段(DNA Extraction from Agarose Gels)
研究室中利用CLONTECH公司所生產NucleoSpin® Extraction Kit 純化組來萃取瓊脂凝膠中的DNA片段。首先，將含所需的目標DNA之瓊脂膠切下，以100 mg 的瓊脂膠(需大於 2％ agarose)對應 300μL Buffer NT 1 的比例加入含已切下瓊脂膠的離心試管中，放入50℃水浴槽中10分鐘，待凝膠溶解後，將所有液體移入純化組件所附的離心管柱(NuclroSpin Extract Spin Column)中，在室溫下1300rpm離心1分鐘，丟棄下層液，接著加入600μL 的Buffer NT3，以相同條件下進行離心，然後丟棄下層液，再接著加入200μL 的Buffer NT3，以13000rpm 離心2分鐘，完全移除Buffer NT3中的酒精，避免抑制酵素反應。完成後將上層套管(NuclroSpin Extract Spin Column)移置乾淨的離心管中，並加入25-50μL的Buffer NE 置室溫下等待1分鐘後，以轉速13000 rpm 離心2 分鐘，離心試管內的液體即為所欲純化的DNA片段，將其液體儲存於-20℃下保存。
2.2.3PCR DNA 純化(Isolation from PCR Reactions)
將PCR reaction 所得到的DNA 經由CLONTECH 公司所生產
NucleoSpin® Extraction Kit 純化組來純化。首先，以pH 7-7.5 的TE buffer 將體積調整到100μL，接著加入400μL Buffer NT2 並充分混合，將所有液體移入純化組件所附的離心管柱中，在室溫13000rpm 離心1分鐘，丟棄下層液，接著加入600μL 的Buffer NT3，以同條件下進行離心，然後丟棄下層液，再接著加入200μL 的Buffer NT3，以13000rpm 離心2分鐘，完全移除Buffer NT3 中的酒精，避免抑制酵素反應。完成後將上層套管(NuclroSpin Extract Spin Column)移置乾淨的離心管中，並加入25-50μL 的Buffer NE 置室溫下等待1分後，以轉速13000rpm 離心2分鐘，離心試管內的液體即為所欲純化的PCR DNA，將其液體儲存於-20℃下保存。
Table 2.2 TE Buffer 配製 1

2.3 染色體純化方法(Purification of Chromosome )
研究室中利用Promega 公司所生產Wizard® Genomic DNA
Purification Kit 純化組來萃取染色體。首先，取1 mL 培養至適當濃度(overnight culture)的菌液，離心後移除上層液，接著加入600μL Nuclei Lysis Solution與菌體充分混合，使其懸浮，再置於80℃水浴槽5分鐘使其溶解，取出待冷卻至室溫後，接著加入 3μL RNase
Solution，緩慢的混合後，置於37℃水浴槽15-60分鐘後，再取出冷卻
至室溫，接著加入200μL Protein Precipitation Solution，強力震盪(vortex) 20秒，使其充分完全的混合後，置於冰中5分鐘，接著以13000rpm離心3分鐘，吸取上層液置於乾淨的離心試管中，然後加入600 mL室溫的異丙醇(Isopropanol)，緩慢混合直到絲狀DNA出現，接著以
13000 rpm離心2分鐘，離心後丟棄澄清液，再加入70 % 酒精(Ethanol)
清洗DNA，並以同條件下離心後，再用微吸量管(pipet)小心的移除酒
精，置於37℃烘箱烘乾，然後加入100μL DNA Rehydration Solution，
置於室溫12小時或於65℃水浴槽中1小時後，離心試管內的液體即為欲所純化之染色體，將此染色體保存於2-8℃暫存，若要永久保存則放置-20℃下保存。(針對革蘭氏陰性菌 Gram Negative Bacteria)