微脂粒的原理及用途

Question

純粹想知道多一點其他ㄉ知識～有人知道ㄉ話麻煩請跟我說～感恩ㄚ～

Answer 1

 開啟醫藥領域的新紀元-微脂粒傳輸技術　        微脂粒傳輸系統（Liposomal Drug Delivery System）是近年來發展快速的一種給藥技術，美國於1995年正式核準第一個微脂粒產品?/FONT>Doxorubicin上市後，即開啟了微脂粒在醫藥領域的新紀元。微脂粒是由磷脂質水合後所形成的雙層脂肪球，由於其特殊的雙層膜結構與可控制的粒徑大小，因此可被用來包覆親水性或疏水性藥物，並做為標的給藥的藥物載體。而微脂粒做為藥物傳輸系統可歸納為以下幾個特點： 具有包覆親水性、疏水性藥物之特質，由於微脂粒之外層具親水性，所以亦可增加疏水性藥物的水溶性。 微脂粒與細胞膜有相似之脂質結構，因此本身具有生物相容性（biocompatible）及生物降解性（biodegradable）的特性，為低毒性的載體。 保護藥物使其輸入生體後不受到新陳代謝系統之分解，提高藥物的可利用率，並降低高毒性藥物對組織器官之傷害，如Amphotericin B具有腎臟毒性、Doxorubicin導致心臟毒性、而Cisplatin及Vincristine則會影響末梢神經。 藥物包覆於微脂粒間，能達到緩釋控制之效果。藉著微脂粒載體組成及粒徑大小的不同，可改變藥物動力學（pharmacokinetics），提高血中濃度，並可改變藥物在生體組織的分佈（biodistribution）。 可攜帶藥物進入體內循環系統，到達病灶，再將藥物釋放出來，達到標的給藥之效果，減少副作用。另外亦可協助藥物（如DNA分子）進入細胞膜內，以提高藥效。         由於微脂粒具有以上特質，因此目前開發的產品多集中於高毒性的抗癌藥物及抗感染藥物或高刺激性的皮膚藥物。其2000年全球市場值為12億美元，到了2005年預計可高達33億美元的產值，極具市場潛力。        針對此種市場性與技術創新兼具的微脂粒標的給藥技術，工研院生醫中心，先後發展了「抗癌藥物Doxorubicin微脂粒技術」、「抗癌藥物Paclitaxel微脂粒與乳化液技術」…等應用於癌症化學治療之注射用藥，可降低藥物毒性與副作用，並開發「All-trans Retinoic acid （RA）微脂粒凝膠」，以降低RA對於皮膚所造成之紅腫與刺激性。前述微脂粒技術之開發，包括配方設計、實驗室製程建立、分析方法建立、安定性試驗、製程放大與前臨床動物試驗等項目，不僅已突破多項技術瓶頸，同時亦將協助廠商進行臨床試驗，對於微脂粒標的給藥技術應用於產業界，建立了一系列完整的產品開發流程與平台技術。        在微脂粒技術開發過程中，關鍵的技術主要包括可包覆高量疏水性物質的微脂粒載體及含Vitamin衍生物的穩定型微脂粒，前者應用於Paclitaxel微脂粒劑型設計上，具有極為突出的效果。由於疏水性藥物包覆於微脂粒雙層膜中，安定性不佳，根據大部份的文獻報導，安定性皆不超過一個月。目前生醫中心針對此一重要關鍵已研究出能夠提高Paclitaxel藥物含量，而且穩定的微脂粒配方。主要原理為開發的配方運用了脂質不同相之間的邊界障礙，避免疏水性藥物自行聚集，因此可以提高Paclitaxel在微脂粒膜內的包埋量及穩定性。試驗結果顯示，目前開發出的配方性質優異，超越目前文獻資料報導者，其Paclitaxel/lipid比例可高達1：7，藥物含量約2 mg/mL，而且在4℃儲存穩定性可達一年以上，而粒徑大小約在110~120 nm左右，此技術已申請台灣、中國大陸與美國專利。         而另一項技術則分別應用於Doxorubicin微脂粒及All-trans retinoic acid微脂粒配方設計上，目前正準備申請台灣與美國專利。此技術應用於抗癌藥物Doxorubicin，已證實所開發之Doxorubicin微脂粒配方具有「長效緩釋」的功能特性，可在體內循環達24~48小時不等，顯示所開發具新穎性配方能夠避開免疫細胞之吞噬，而將藥物送至腫瘤或病變組織，具有降低藥物毒性、標的給藥之特性。目前開發之微脂粒粒徑大小約100 nm，藥物濃度2 mg/mL，包覆率大於95%，安定期超過兩年，已進行1~10 L的放大試驗，隨時可進入臨床試驗。此外Vitamin衍生物應用於All-trans retinoic acid微脂粒技術上亦有很好的效果，不僅可將助溶劑大幅降低，並同時增加All-trans retinoic acid的溶解度，因此開發之產品，不僅能將藥物濃度提高至0.1%，粒徑小於100 nm，而目前其安定性已達一年以上亦超過一般文獻之報導。
圖片參考：http://www.chemnet.com.tw/magazine/200206/Image298.gif
        微脂粒（如上圖）給藥技術不僅可作為藥物的包覆載體，達到降低副作用，標的給藥的作用，其另一應用範圍極廣的用途在於作為進行基因治療的基因載體。眾所皆知，基因治療目前85%以上使用病毒載體，而病毒載體易引起無法預知的免疫反應，導致極高的毒性，而危及病人的生命，因此非病毒載體如微脂粒就成為很好的選擇。但利用微脂粒做為基因載體最主要的缺點，在於無法進入標的細胞進行gene expression，因此在微脂粒表面增加與標的細胞具鍵結力的ligand，引導治療物質進入病變組織，即為「主動標的」的精髓，因此我們深信主動標的給藥技術將是提高非病毒載體efficiency最佳的選擇，亦為未來發展的趨勢。抗癌新藥微脂體－Doxorubicin 前言Doxorubicin是一種廣泛使用及對多種癌症均有治療效果的抗癌舊藥，其主要作用機制是經由螯合DNA、抑制topoisomerase II和產生氫氧自由基等作用來毒殺細胞。因此除了一般常見的化療副作用：如嘔吐、噁心、黏模組織發炎和脫髮外，由於心肌對氫氧自由基的傷害特別敏感，使doxorubicin容易對心臟產生累積性的傷害而致命，因而限制了這個藥物的多次使用。目前已知改變投藥方式，使藥物在血中的濃度降低，可能可以降低心臟毒性。因此，利用微脂體(liposome)包裹doxorubicin，使未包裹藥物的血中濃度高峰降低，避免藥物與正常組織直接作用，應可有效的減緩副作用並可能減低doxorubicin的累積性心臟毒性。微脂體－Doxorubicin的發展史自 1970 年起，微脂體即被認為是載運藥物的好劑型，其理由如下：第一、 微脂體是由磷脂質構成，其與細胞膜成份相同，在生物體內能被分解，所以不具毒性，而且不像蛋白質會引起免疫反應，能夠多次使用；第二、藥物包在微脂體內，會改變藥物的動力學，增加藥療率；第三、 毒性高的藥物包裹在微脂體內，可以減少不良的副作用；第四、微脂體的脂質組成、顆粒大小、結構、製備的方法與包裹藥物的選擇性很大，能夠符合各種不同的情況，進行各種應用。早期使用磷酸脂製成微脂粒時，由於技術的限制，利用脂質薄膜水合法，只能製造出多層膜所構成的大微脂粒，即多層囊泡，這種微脂粒，因為脂雙層間的含水量少，顆粒大小不定，應用有限。目前，由於製造法的改進，已經可以利用薄膜水合法、有機溶劑注射法、清潔劑透析法等配合濾膜擠壓法來製造單一脂雙層且大小一定的微脂體，顆粒大小由濾膜孔徑決定，並可應用於製藥工業，適合大量製造。除了製造方法外，早期的微脂體常使用天然脂質作為原料，天然脂質中常含有帶負電荷的磷酸脂，使製成的微脂粒表面帶負電荷。這種帶負電荷的微脂粒很類似細胞凋亡後產生的分解顆粒，因此注入血液循環時，將迅速被單核吞噬系統或網狀內皮系統之細胞吞噬。因此早期的微脂體只能運送藥物至上述器官中，應用的範圍被限制在此小範圍內，微脂體只能運送藥物至巨噬細胞等吞噬細胞中，用途也僅限定於治療一些感染至吞噬細胞的疾病，如萊什曼病等。此外，血液中的高密度脂蛋白也會將天然脂質構成的微脂體的磷酸脂質移除，使微脂體崩散，進而造成藥物由微脂體內漏出，影響藥物循環的半衰期。為了增進微脂體載運藥物的應用範圍，在多年的研究後，發現下列幾項因素影響微脂體包裹藥物在血液中的循環時間：(1) 中性脂質組成的微脂體較不易被網狀內皮系統清除；(2) 顆粒較小的微脂體較不易被清除 ；(3) 由高過渡溫度脂質和高含量膽固醇組成的微脂體較穩定；(4) 微脂體表面以polyethyleneglycol (PEG) 保護可以延緩在血液中的清除速度。因此最新一代的微脂體製劑，便是利用高過渡溫度脂質和高含量膽固醇做成直徑 100 nm 左右的微脂體包裹 doxorubicin，因而提高微脂體－Doxorubicin的血液循環半衰期，而且這樣大小的微脂體能穿過腫瘤新生血管壁的漏洞，使包裹抗癌藥物的微脂體能大量累積在腫瘤，增進治療效果。微脂體－Doxorubicin的副作用在對小鼠的毒性試驗中，可以明顯的發現微脂體－Doxorubicin在體重維持及對各重要器官組織的傷害降低方面均有其優異性，此外，每週給藥一次的亞急性致死試驗中，約為未包裹doxorubicin 的兩倍。在臨床試驗中，亦發現微脂體－Doxorubicin的副作用，可以降低如嘔吐、噁心和脫髮等較未包裹doxorubicin為低，但是黏模組織炎則較為常見，且少數病患在初次注射過程會產生過敏現象，但只要立即停止給藥即可緩解，此外並有降低心臟毒性，增高給藥次數的潛能。微脂體－Doxorubicin的臨床應用已知與微脂體－Doxorubicin對於較嚴重的AIDS related Kaposi’ s Sarcoma病人有80%左右的治療效果；對於曾經接受其他化學治療失敗的病人仍然有40%左右的治療效果。此外，51位曾接受Cisplatin或Paclitaxel治療失敗的卵巢癌患者，以單一微脂體Doxorubicin治療。其有效率為26%，中間值存活期為11個月。雖然其中有13位病人感受到第3級或第4級的皮膚或黏膜毒性，但是病人整體的耐受性都不錯。微脂體－Doxorubicin於轉移性乳癌之治療最近在歐洲的臨床報告顯示，71位轉移性乳癌病人，單一使用本項新藥治療，有30%以上的療效，中間值存活期為7個月。其中28位病人曾經使用傳統治療乳癌藥CMF治療無效，而仍然有三成左右可以獲得有效控制。此外在美國所進行的臨床試驗亦顯示，20位晚期的乳癌病人，其中16位曾經使用CMF治療無效。經微脂體－Doxorubicin治療後，有效率為45%，而且有效率平均可持續7個月。本試驗亦證實在Doxorubicin累積劑量500至880mg/m2時，微脂體Doxorubicin比一般Doxorubicin的心臟毒性小。微脂體－Doxorubicin今後的研究方向微脂體製劑改變傳統抗癌藥物的藥物動力學，使藥物能經由微脂體在血液中長時間循環，而被動的大量累積在新生血管眾多的腫瘤部位。因此利用微脂體在血液中長時間循環的性質，及微脂體表面容易用標的性配位基或抗體修飾的特點，將有助於抗癌藥物的定點傳送，更進一步的減低副作用並提高療效。此外，將其它傳統抗癌藥物包覆在微脂體內，製造新的微脂體抗癌製劑，也是將來研究的方向。在臨床研究方面，微脂體－Doxorubicin搭配其它化療藥物的最佳組合及微脂體－Doxorubicin合併放射線治療等研究，都是將來值得繼續研究的方向。

Answer 2

微脂粒(Liposome)是由多層親水層及親油層所組成的微小顆粒
體徑約0.0025~3.5um，約為皮膚細胞的1/300
結構與人體細胞類似，懸浮於水相中
脂質膜(球皮)主要是由磷脂分子的磷酸端所構成的脂質雙層(liposome bilayers)
磷脂分子的磷酸端為親水性，脂質端為疏水性
由此所形成的脂質層雙面為親水，夾層內為疏水之膜。

微脂粒最早是在西元1965年，由英國Dr. Bangham所發現
因其結構類似細胞膜而開始研究其特性
到1970-1990年間，科學家對於其結構之物理化學性質有更深的研究及了解
加上製備方法及品質管制方法的建立
開始應用在藥物傳輸系統上
水溶性物質(藥物等)可包在球心之溶液
油溶性物質可夾在球皮膜層內(好像三夾板)
因此微脂體可當做水性物質及油性物質之載體
1990年代以後，脂質來源品質穩定
科學家投入更多心血研究微脂粒技術，後經臨床試驗證實
微脂粒藥物傳輸系統具有降低藥物毒性、標的給藥及提高藥物使用率等優點
為一優良之藥物載體
目前已上市的微脂粒產品有：
Alza Corp.公司以Stealth Liposome技術發展出用於治療癌症的DoxilR
治療系統性黴菌感染的AmphotecR
Gilead Science公司發展出微脂體內包覆Daunorubicin藥物的商品DaunoXomeR
及包覆Amphotericin B的AmBisomeR
以上產品均已在美國及歐洲等地上市
至於其他公司陸續發展的產品目前多仍在臨床試驗的階段
預估其市場潛力約為每年20億美金
目前已核准使用liposome的國家：
歐洲：英國、愛爾蘭、澳大利亞、、盧森堡、匈牙利、法國、西班牙、葡萄牙、比利時、瑞典、挪威、丹麥、芬蘭、冰島、荷蘭、土耳其、希臘、塞普勒斯、義大利、奧地利、瑞士
美洲：加拿大、美國
亞洲：新加坡、香港。台灣目前臨床研發中。

Answer 3

目前有許多國家在進行基因治療相關研究。所使用之基因傳媒（vector）大體可分為病毒及非病毒。微脂粒是非病毒傳媒代表。微脂粒（liposomes）是脂質空心微球，粒徑約0.025~3.5μm，懸浮於水相中，脂質膜(球皮)主要是由磷脂質所構成的脂質雙層（lipid bilayers）。因其脂質膜與細胞膜近似，又具有可與細胞膜融合或被細胞吞食等特性，以及可依用途量身裁製之多樣性，因此成為最具潛力之基因載體。微脂粒依其大小、性狀或製備方法不同而有各種名稱。依型態分類最常見者為：MLV（multilamellar vesicle多層微脂粒)， LUV（large unilamellar vesicle單層大微脂粒）及SUV（small unilamellar vesicle單層小微脂粒）。作為基因傳媒最常用SUV。微脂粒應用於基因傳媒之研究始於1980年代，當時之方法是將DNA包埋於微脂粒內，其基因轉染效果很低，經過研究改進，發展出正電荷SUV，使其吸著於DNA（帶負電荷）周圍形成DNA-微脂粒複合體，將DNA送入細胞內，確實提高了轉染效率。以下是本實驗室之研究心得。

二、 微脂粒為基因傳媒之研究
　　1. 正電荷微脂粒

　　本實驗室於1993年開始嘗試應用正電荷微脂粒為基因傳媒之研究。首先參考文獻1合成正電荷脂質DC-Chol，將合成過程略加改進而提高產率三倍以上2。然後用dioleylphosphotidylethanolamine（DOPE）與DC-Chol製成正電荷微脂粒，使之與plasmid DNA（pN88Z）形成DNA-微脂粒複合體，對三種細胞株HepG2、Hela、Cos-7做 in vitro轉染試驗，在此試驗中亦探討微脂粒/DNA之混合比例對轉染效果之影響，而使用最適比例進行實驗。結果Cos-7之基因轉染效果最高（以β-gal活性表示），Hela次之，HepG2之效果最差3。正電荷微脂粒對HepG2之基因轉染效果必須改進。

　　2. Asialoglycoprotein (ASGP) 微脂粒

　　先前本實驗室曾設計ASGP微脂粒包埋水溶性分子遞送進入HepG2，證明ASGP微脂粒對肝細胞有靶向性4。於是製備ASGP正電荷微脂粒，以DNA-微脂粒複合體方式，分別測試pCMV-β5及pGL-16基因對HepG2之轉染效率，並與市售基因傳媒Lipofectin比較，結果顯示ASGP正電荷微脂粒之傳媒效率（約18%），高於DC-Chol微脂粒（約12%）及Lipofectin（<10%）。同時也由實驗得知在微脂粒中添加胰島素可略為提高轉染效率，而添加血清則降低轉染效率。在in vitro實驗顯示出初步成績後，進一步嘗試in vivo實驗，在Fisher F343大鼠肝臟種植Gp7TB（鼠肝癌細胞），飼養數週待肝腫瘤長大，然後投與pGL-1-ASGP微脂粒複合體，將其注射於腫瘤及其周圍，縫合手術傷口繼續飼養，使基因表現，分別經一天及兩天後，取其肝臟做冷凍切片，在螢光顯微鏡下觀察，結果未見基因表現7。



　　3. Galactosylated正電荷微脂粒

　　ASGP正電荷微脂粒雖然具備肝細胞靶向性且可提高基因轉染效果，然而我們仍不滿意而思改進，因為：1) ASGP是蛋白質，遇到有機溶媒會變質，因此在製造ASGP微脂粒時不可與其他脂質組成混合溶液於有機溶媒，而必須先製造普通微脂粒後再加入含有界面活性劑之 ASGP溶液，應用透析法除去界面活性劑而將ASGP插進微脂粒膜，所需時間較長，所需消耗品（透析設備及透析液）較多。2) ASGP之分子量相當大（蛋白質），可能形成之DNA-微脂粒複合體大得不易穿過血管壁。3) ASGP是蛋白質，要顧慮抗原抗體反應。基於ASGP之末端為galactose，我們構想利用galactose而捨棄蛋白質部分，因而自行合成galactose lipid，在galactose與脂肪酸之間介入polyethelene glycol（PFG），使得脂肪鏈插入微脂粒後，PEG成為手臂使galactose端充分裸露，另一方面PEG之親水性有保護微脂粒免受血液中opsonin之襲擊之功能。Galactose lipid可溶於有機溶媒而不變質，因此在製造微脂粒過程中可與其他脂質組成混合溶於有機溶媒製成Gal微脂粒，在製備時間及過程上有所節省。其傳媒效率之評估則進行轉染pGL-1基因至HepG2、BNL CL.2（小鼠正常肝細胞株）、NIH3T3（對照用）之in vitro實驗。結果Gal正電荷微脂比普通正電荷微脂粒之傳媒轉染效率在HepG2提高1.9倍，在BNL CL.2提高1.2倍，在NIH3T3則無提高現象，在BNL CL.2之轉染率高達45%。

　　正電荷聚合物（cationic polymer）如polylysine，polyethyleneimine，protamine等，可能因其可凝縮DNA而抑制粒子間之凝集及抑制DNA被nucleatase分解而提高轉染效率8。我們嘗試藉由protamine之添加來提高Gal正電荷微脂粒之媒傳效率，因而添加不同比例之protamine於DNA後（protamine/DNA= 0、0.4、0.6、0.8、1.0 w/w），再與Gal正電荷微脂粒形成複合體轉染HepG2，結果在比值為0.6~0.8時之轉染率增加1.2倍，但當比值為1時，轉染效率反而下降，推測是因為過量的protamine（正電荷）妨礙了Gal正電荷微脂粒與DNA凝縮體形成複合物之故。本實驗對肝細胞靶向性基因傳媒微脂粒有明顯改進。

三、 人類皮膚為目標之基因傳媒微脂粒之設計
　　皮膚是很值得考慮之基因治療組織，因其監測較其他組織方便，又無血清之干擾。或許亦可應用皮膚移植技術，在in vitro做皮膚基因轉染後再移植到活體。皮膚基因療法不僅可應用於治療基因性皮膚病，亦可藉由皮膚細胞之基因修飾生產治療用蛋白質以治療全身性疾病。

　　我們嘗試設計角質細胞靶向性微脂粒做為基因傳媒。角質細胞膜表面有些蛋白質具有凝集素（lectin）性質，對rhamnose的親和力很大9，因此設計了rhamnose正電荷微脂粒。Rhamnosyl lipid之合成及純化步驟、微脂粒之製造過程等，皆如上述Gal正電荷微脂粒。用製得之rhamnose正電荷微脂粒遞送基因pGL-1至人類角質細胞株HaCaT，同時做普通正電荷微脂粒(無rhamnose)比較，結果rhamnose正電荷微脂粒之效率明顯高於正電荷微脂粒（32%對25%）。適量之protamine（protamine/DNA=0.8 w/w）可提高轉染率1.3倍，過量protamine反而抑制轉染效率。此點與上述Gal正電荷微脂粒加protamine轉染肝細胞之現象一致。本實驗室自行設計之rahmnose正電荷微脂粒可開發為轉染人類皮膚為目標之基因傳媒。

四、結語及展望
　　製造非特定微脂粒的步驟很簡單，可是要設計及製造合適而又實用的微脂粒則涵蓋的知識範圍廣，技術也不簡單。以裁製衣服為比喻，做衣服很簡單，拿一個布袋在袋底中央剪個洞當領口，兩側近底各剪個洞當袖口即成形。但要量身配合場合設計出穿者滿意，觀者讚賞的時裝或禮服，就要設計樣式（配合場合、合於穿者個性、喜好）、慎選布料、正確量身、精工縫製、滾邊、繡花、選釘鈕釦等。近年來基因工程學、分子生物學、細胞學、抗體分離技術等快速進步。某些基因相關疾病之作用機制已經明朗，其預防或治療理論也已建立。然而基因療法之臨床研究尚未達到期望之效果，原因之一是基因導入技術尚不理想。

　　微脂粒為基因傳媒之體外試驗已表現出相當成效。若再加強對基因藥品及微脂粒之物理化學性質、安定性及體內動態特性之研究，則設計出臨床實用基因傳媒用微脂粒之構想應可實現。