組織培養的方法?

Question

我想知道過程~愈詳細愈好~謝謝!~
ps:最好有自己的理論心得~

Answer 1

組織培養之發展概況組織培養(tissue culture) 一詞可算是一個定義不算明確的集合名詞，不論器官培養、胚胎培養、組織（癒傷組織）培養、液態懸浮培養、細胞培養等都稱為組織培養，所以以前歐美將它當做概括性的名詞，但現在已有所區分。目前在臺灣大多數人，甚至於許多科學家都還沒將它分清楚，就只用組織培養一言以蔽之。Gottlieb Haberdandt 在1902年第一次清楚的說出為何想要培養自植物體分離出的細胞，其原因在於，他看到了細胞及組織培養可在形態發生學上提出絕妙的研究工具之遠景，雖然他的嘗試最後失敗了。1930年代以前，培養分離的細胞或組織之方法的進步飛常少，但在1930年代由幾位研究學者所發生出的新技術，導致成功的無菌培養許多不同種植物根部的例子。第一次成功的例子則發生在1922年，由Kottle 及Robbins 使初萌發的無菌燕麥芽的根生長了一小段。另一個重大發展發生於1938年，當時培養出紅蘿蔔的癒傷組織及菸草鑲嵌腫瘤組織。跟隨這些成功例子之後的是一連串的組織培養液及培養方法的改良，使得科學家可以用組織培養的方法培育出各式各樣種類植物的器官及癒傷組織。到了1960年代時，培養的技術、方法到了近頂點，科學家利用各種特別的方法培養單一細胞、液態培養懸浮細胞以及不含細胞壁的原生質體細胞。(或受精卵)所分裂分化而來的。分化的原理是細胞接受生長因子或荷爾蒙的刺激，導致細胞漸進的表現或抑制某些基因的表現(除少部分細胞種類會改變基因結構外，其餘的基因均無改變)，因此展現出獨特的生理或形態的面貌。所以組織細胞除了最基本的養份之外，還需要許多生長因子或荷爾蒙才能維持其正常生長。例如，植物根部組織培養的細胞，除了最基礎的N、P、Ca、Fe、Mg、Mn、Cu、Zn、B、Mo、S、K等鹽類、氧、氮、維他命B群、氨基酸、糖類之外，還需要auxins 及cytokinins等的荷爾蒙，且其比例要夠高才行。所以組織特有的荷爾蒙及其調控是除了基本養份及汙染問題之外影響組織培養的最大因素。由於組織特有荷爾蒙的調控既複雜又精巧，因此現在許多的組織培養都有用到”護士細胞”或”保母細胞”來模擬組織內部的荷爾蒙環境。例如常用的纖維母細胞的培養就會用結締組織的細胞來當護士細胞，以提供其必需的生長因子及調控。(如基本的養份需求、種類，生長需不需特定的固著環境，分裂週期的時間長或短等等)以細胞學、組織學及內分泌學的知識判斷之，但最重要的是以實際的實驗結果來修正嘗試的方向。海藻組織培養與生物技術的過去，現今與未來 將生物技術十分熟悉的運用到海藻的研究尚處於起步之階段。這種尖端技術用於這全然不同的藻類區域是如此的新，以致於其專有的用語仍未被當今少數活躍於海藻的研究者，有一致的甚或清楚地定義。海藻組織培養、細胞癒合組織(callus)與原生質體(protoplast)等，這些名稱在海藻生物技術方面的敘述通常不是很嚴謹。所以，雖然有關一些海藻組織培養的文章，其可能包含從事於海藻細胞，”器官”原生質體，與其他的營養細胞的增殖等方面，它們的名稱應盡可能為特定的。不久的將來有必要發表一篇包含專有名詞的用語和適當定義在的文章。 I．五十與六十年代： 海藻生物技術是一個年輕的，有前途的領域。然而，一般而言在某方面正被誤導，其認為海藻組織培養及藻類學之生物技術為一”短暫的過去”。海洋的與鹹水的植物栽培的重要性，已被淡水農業所取代的情形已經存在很多世代。發展海洋植物組織培養系統實驗的記錄，能被追蹤至四十年代晚期或五十年代早期，相當於第一次成功的發展森林樹木組織培養的年代。在那時候的學生在海藻組織培養的意圖，由於對這刺激的、新的器官及組織培養的未知領域的無知而遭受挫敗。一個過去從事此方面的學生，現在是加州大學海藻生物技術的教授Aharon Gibor。他於1950在U．C．Berkeley，在P．L．Kirk指導下的一個年輕的博士班學生，他開始以海藻組織實驗，開發一個可能將海洋生物養於沙漠國家的系統。然而，將陸上植物的組織培養技術轉移到海藻上卻是很複雜的。在Stanford大學的Hopkins海洋站，Gibor一個博士班學生，企圖培養褐藻Cystoseira的組織。其在教授 L. Blinks的指導與經過研究組織培養的方法論之下，Cystoseira的組織變成一個海藻發育及分化研究的系統。這海藻有二種形態，一為較低平、茂盛的葉狀體，與另一較高的圓柱狀葉狀體其上有小的浮球組織(pneumatocysts)，此結果為研究組織發育的生物學家至今留下一個吸引人的系統．早期研究海藻組織培養的意圖被二個主要原因妨礙了。其中之一是，無菌的海藻組織很難準備。另一個原因為，缺乏控制成長與分化等方面的知識。在海藻表面有微生物造成污染，它們在這豐富的培養基(海藻)上茂盛成長而取代緩慢生長的海藻組織，殺死它們或抑制它們的成長。同時缺乏使海藻有效的成長和分化的物質，以至不可能控制其組織的形態與成長的形式。 無菌海藻組織的製備 在這水中環境的演化，海藻並沒有保護層與厚的表皮。它們薄且缺乏蠟質的表皮層是比陸上植物更細緻。因此無菌組織的準備是特別細緻的工作。從陸上植物除去表面污染，其分裂組織被年輕的葉子層或蠟質的表皮所保護。將根，葉子，分裂組織，芽或種子在被浸入防腐劑溶液，諸如：次氯酸鈉或酒精，如此處置可能殺死表面的生物群聚和外層的保護細胞。由於大部份的海藻，外在細胞同時也是分裂組織的細胞，然而於很多培養的例子上必須嚴厲的清洗下，嚴重損害這些細胞。早期挫折的事情，包含無止盡的觀察被氯酸或酒精溶液處置之後的海藻小組織片斷。這些組織是無菌，有正常的色素，某些組織曾經放出”正常的”螢光，但卻不成長。那些是”被固定的很好的非生殖性的組織(sterile tissue)”，”可是我們從不能分辨出他們是活的或是死的”，如Gibor reminisecs博士所說。在五十年代早期抗生素才剛被發現且他們的有效性被其多變性及供給量所限制。Fleming(1928)博士發費30年時間，才於青黴菌中發現有效之抗生素，經Florey與Chain博士在1940年早期分離這化合物，使得更多的抗生素從細菌與黴菌中被識別和分離出來(Waksman, 1945)，直到在工業上被開發出一種最大限度與經濟上重要的藥品為止。今天於無菌的組織的準備的成功，大部份是依靠各種不貴且有效的抗生素。如同一個博士後研究員(1961, Rockfellor Inst. Sci., New York, with Dr. S. Granick )Aharon Gibor博士，在於緬因州Jackson實驗室跟隨著高等植物組織培養之父，Philippe White博士一個夏季時間，從事綠藻傘藻的一個產生不孕的帽子(cap)為方法[1]。其使用含銀液(argyrol)與抗生素，消除表面的污染。這海藻的囊因為有這兩個帽子壁所保護而存活。從這無菌的胞子發育的植物被切割後其細胞質體(cytoplasts)被滴入培養基中，這些”細胞質體”存活二星期之久，但卻不再生細胞壁[2]。自此從syphonious海藻的多核原生質體再生形成正常植物體的有趣研究被陸續報告[3,4,5,29]．在那時候其他熟悉將組織培養技術應用海藻的科學家，同時也面對的需要無菌的海藻組織這相同問題。大型藻類的無菌組織的各種消毒方法，在過去數年裡被開發出來。Fogg [6]使用紫外線的輻射，Fish [7]，Spencer [8]，Provasoli [9]，Boalch [10]，Fries [11]，Polne-Fuller等人[12]，與Chen＆Taylor [13]將植物組織拖曳經過含有各種不同抗生素的膠化體洋菜膠上，來消毒。Fries [14]，與Lee [15]使用乙醇與氯酸溶液來清潔昆布組織。於1980 Polne等人[16]介紹使用超音波處置，其為一有效的事先清洗大型藻類上微粒子與疏鬆細絲狀上的污染物的方法，而Gibor等人[17]，介紹結合碘液、抗生素與超音波振動的使用。這些不同的結合成為我們的實驗室常規的使用方法[18]。 以污染物為賀爾蒙的來源： 一個可能的困難在Pedersen[19], Fries [20], Provasoli＆ Pintner [21]，與Tatewaki等人[22]的無菌組織工作中出現。經過這些研究它變成明顯的證據那些自然地發生的”contaminants”提供給其所寄生的海藻成長與分化的因子。當附生在植物的”污染物(contaminants)”完全被移除，造成石髮遲緩地發育成異常的單條絲形的葉狀體。石蓴在缺少附生的細菌時，同樣地發育成'針墊子'之怪形態。當增加特定的細菌後，此二植物部份的葉狀體恢復正常的形態。在青海苔中也發生此種類似的形態變化。另外一個典型的事例，當添加培養過細菌的培養液或者無菌培養的褐藻與紅藻的培養液後其形態恢復原狀。這三例子清楚地指示在培養環境中，不論是在這些海藻本身上面或者是於它的附近（褐藻與紅藻）的生物提供多樣的成長與分化因子的物質。不幸地，這些化學藥品(因子)的身分仍然是一個迷。只要促使海藻成長與分化因素依然未知，是不可能組成完全的培養基來控制組織、細胞癒合組織或細胞的發育。雖然，現今成長因子素被清楚地應用於一群海藻中[23]，但此種應用於高等植物的成長與分化的賀爾蒙，應用於海藻顯示出非常不一致的效果[24, 25, 26]。此種存在於海藻中特定的有效物質能仍未被鑑別和分離出來。 第二．七十與八十年代： 海藻組織與細胞培養的研究從不中止。好奇的科學家與他們的學生可能從不被告訴在實驗中很多挫折的故事。但隨著歲月的過去，有用的資訊片段亦不斷累積。很多海藻的分枝被的切成片斷，猶如正常的生活史般[23, 27, 28]。從綠藻、紅藻與褐藻的'非無菌'培養的小葉狀體已能成功增殖成一般植物體。海藻可由極細小的組織切塊及由少數活的細胞順利再生[3,13,29,30,31,32,33,34]。在 Arne Jensen及Edgar DaSilva教授於1972年未發表的實驗中，他(她)們觀察到紅藻杉藻的100μm的受傷片斷培養於一個置放於增強營養的海水內的透析袋中，有再生且存活的現像。在八十年代早期於我們的實驗室及在"Neushul Mariculture Inc" 也在做vegetative micropropagation實驗。石花菜robustum，G．Nudifronds，與杉藻papilata的細小切片再生成年輕的植物，此植物體接觸到塑膠繩索表面而長出假根並附著其上。除了一些不附著於基質上的藻類外，紫菜、Smithora maiadum、石髮與石蓴的組織切片在培養後均可成長(Polne-Fuller，未發表資料）。在J．Hansen博士的實驗中，龍鬚菜的組織切片亦有類似的再生情形。Chen＆Taylor [13]於當時出版有關海藻組織與細胞培養等方面的文章。於他們的研究，紅藻角叉菜骨髓組織的無菌的立方體小塊再生成完全小植株。事實上，無色素的骨髓細胞分化成具色素的表面細胞，且骨髓組織的立方體小塊分化成完全的植株，再次強調海藻的高再生能力，並增加人們對其組織培養的興趣。在那個時候，由高等植物的組織、細胞與原生質體研究的順利進展而鼓勵單細胞海藻的原生質體主動地被研究[36]。陸上植物原生質體順利融合[37]和體細胞雜交順利再生[38]。科學家當時正在計畫一個種內之基因組工程與越過系統發生學障礙[39]的研究。這一切成果使藻類學在研究實驗中保持高度的刺激、興趣與警戒。1980年於加州海Aharon Gibor與Michael Neshu博士獲得一個名為”海藻組織與細胞培養的預備研究”的補助來研究組織發育的技術。最初的工作相對地集中在這簡單的紅藻紫菜。當組織消毒的技術被開發後，原生質體與單一的細胞被混合蝸牛內臟的萃取液的酵素所製備出來。這些原生質體再生細胞壁並長成年輕的小植株[40]。同樣的實驗中顯示，如果將單一細胞或原生質體培養在介於固體的表面(膠體或濕濾紙)與水飽合的空氣相中，它們會發育成細胞癒合組織。目前，在組織、細胞與原生質體的準備和培養的一些報告，已經被發表了。Saga等人[41]報告經由一種黃色的細菌產生一種化合物可控制Dictyosiphone的原生質體分化與形成細胞癒合組織的。Saga＆Sakai [42]於1983報告昆布的細胞癒合組織在洋菜膠表面被引誘形成。Polne-Fuller＆ Gibor [43, 44]報告了一些海藻的組織與細胞癒合組織之培養，有不同層次的再生和分化情形。這些研究報告石蓴，石髮，紫菜，Smithora，麒麟菜，龍鬚菜，杉藻，石花菜，馬尾藻，Cystoseira，大浮藻，與昆布的細胞癒合組織的形成。他們同時也報告，馬尾藻、Cystoseira、大浮藻、石髮與石蓴原生質體的分離。Cheney等人[45]報告了Aqardiella的組織與細胞癒合組織之培養。 Liu＆ Gordon [46]敘述紫菜組織與細胞癒合組織的培養。Gracia[47]等人所報告了龍鬚菜、凹頂藻及石花菜的組織與細胞癒合組織培養。Lawlor等人[48]報告這褐色的海帶Ecklonia細胞癒合組織形成與培養。於大部份報告，海藻癒合細胞組織是在組織傷害、壓力(stress)及在介於固體的表面（　洋菜膠， Carrageenan，潮濕的濾紙）和飽合海水的空氣相中的狀況之下被"引發(induced)"。引發不分化的海藻細胞大量的分化，和高等植物一般，和荷爾蒙有關的假設是合邏輯[18, 44]的。然而，直到現在我們對此些物質的知識有限，因此研究成長與分化因素的鑑別和分離是非常地需要。單一的細胞與原生質體的分離的一些報告同時也被發表(出版)．Saga等人．[49]報告從昆布分離單一的細胞再生成葉片。於1984 Saga＆ Sakai [50]報告從昆布與紫菜分離出原生質體。其他種類的紫菜的原生質體亦被中國的研究者所分離了，諸如：Fujita＆Migita，Tan， Tseng，Zhao( in Chinese，1981-1985)，(Vol．11-13 Shandong of Oceanography), Waaland [51]亦有以上之報告，Polne-Fuller＆ Gibor[40]的報告亦有正常的小植株之再生。Cheney等人[52]報告從紅藻龍鬚菜分離原生質體，與Ducrex[53]從 Sphacelaria的褐色細絲中分離單一的細胞與原生質體。原生質體同時也從６小時老的墨角藻接合體 [54, 55]被製備出來，其發育成正常，年輕的胚胎。於最近的實驗使用經過改良的酵素，其包含吃海藻的動物鮑魚與海兔的內腸道萃取物，來製備巨大的海帶大浮藻的原生質體，其比先前的分離獲得很大的改善，其可獲得超過106個原生質體/每克新鮮組織。（Kloareg等人，圖表．１與２）。這些原生質體再生出細胞壁，並且有超過60%分化成小的細胞癒合組織。培養狀況如沒有改善者，則細胞癒合組織的分化少於10%。細胞完全的分離而有大量再生的健康的原生質體是未來研究變異、遺傳選擇、細胞雜交及生物技術操作的一個必要的先決條件。在可用的技術中，以傳統的營養需求為例，其能適和孢子或植物分枝的需求，必將能適合於分化的組織或細胞。在1984 [56]展開一個包羅廣泛的藻類基因工程展望會，且最近[57]有許多很好的藻類生物技術評論(review)文章被寫成摘要。有兩篇文章詳細描述藻類細胞癒合組織、原生質體的用處及其它生物技術的應用及其基本研究。 抗病品種的分離： 單一細胞和原生質體運用於選擇能抵疾病抗的品種方面是有趣的。於一些年前在我們的實驗室開始研究被不良感染的紫菜（由博士． T． Mumford供給）。單一的細胞從”大多數死的”葉片中的呈島嶼狀的活細胞（圖表．４）中被分離。在合適的培養狀況下這些細胞發育成細胞癒合組織，其在液體的培養基再生成小植株。在實驗室中將此小植株暴露到這病原性的菌類Pythium（由Migita博士提供）顯示由細胞癒合組織再生的年輕葉狀體可抗病原的感染。不幸地，更進一步的抗疾病實驗與必需的野外測試，仍在實行中（Polne-Fuller，未發表的資料）。此外，從多細胞海藻細胞分離單細胞與原生質體的技術，亦可用於突變因子的誘發及篩選自然界不存在的能抵抗疾病的突變種。 單一細胞和原生質體的固定化： 在工業上特定酵素的固定化是一個例行的程序。近來一個類似程序被用於高等植物原生質體的固定化[58 Draget＆Ostgaard

Answer 2

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癒傷組織~簡單的說!
聚集在傷口表面或由植物的組織(tissue)培養下，生長的一團雜亂而且沒有分化的植物細胞【薄壁組織paren-chyma】。

Answer 5

文字資料太多
可以擷取依些重點再發表